La ricerca presentata nella tesi di laurea di Anita Ferri, oggi dottoranda all’Università di Modena e Reggio Emilia, è stata premiata dalla Regione Emilia-Romagna per il suo impiego in ottica 3R

Uno studio che ha cercato di ridurre al minimo la sofferenza degli animali coinvolti, favorendo sotto diversi aspetti le strategie che consentono di applicare il principio delle 3R (replacement, refinement e reduction): è il lavoro della tesi di laurea magistrale di Anita Ferri, dell’Università di Modena e Reggio Emilia, premiato dalla Regione Emilia-Romagna proprio per il suo impegno nelle 3R – come già gli studi condotti all’Università di Parma di cui abbiamo raccontato qui.

Una chiocciola come modello


In questo caso, lo studio presentato nella tesi è concentrato su una chiocciola d’acqua dolce, Pomacea canaliculata, una specie di origine tropicale e subtropicale che sta entrando in diversi laboratori, a livello globale, grazie ad alcune caratteristiche che la rendono attraente dal punto di vista della ricerca. Molta invasiva (in effetti, è inserita nella lista delle cento specie più invasive al mondo), è importante anche dal punto di vista sanitario perché, pur se inizialmente commerciata per l’alimentazione, rappresenta l’ospite intermedio di un nematode in grado di parassitare gli umani. Inoltre, la sua capacità di rigenerare l’occhio e il tentacolo cefalico, quello cui spesso ci si riferisce erroneamente come “antenna” delle lumache, l’ha resa d’interesse anche nell’ambito della medicina rigenerativa.

A ciò, si aggiunge un crescente interesse per Pomacea dal punto di vista immunobiologico – cioè lo studio delle caratteristiche biologiche del sistema immunitario. Nel caso dei gasteropodi, quest’ultimo consiste nella sola immunità innata, ossia quella priva di specificità per i patogeni (diversamente, per esempio, dagli anticorpi). «Pomacea rappresenta un valido modello per questo tipo di studi ed è possibile indagarne gli emociti, cioè le cellule circolanti, senza far soffrire l’animale. Possiamo infatti prelevare l’emolinfa (il corrispettivo del nostro sangue in molti invertebrati) facendo pressione sull’opercolo, il disco che chiude la conchiglia quando l’animale vi si ritira all’interno. Subito dopo il prelievo, l’animale riprende le sue attività abituali, senza mostrare segni di stress: si nutre, esplora l’ambiente, allunga i tentacoli cefalici… Insomma, il contrario di quello che fa un animale stressato, sofferente o spaventato, che si ritira nella conchiglia», spiega Ferri, oggi dottoranda al Dipartimento di Scienze Chimiche e Geologiche dell’Università di Modena e Reggio Emilia.

Imparare a riconoscere le cellule


Scopo dello studio era quello di identificare dei marker, delle molecole che consentano di riconoscere i diversi tipi di emociti circolanti nell’animale. Prima di arrivare a lavorare sull’animale, però, vi è stato un ampio lavoro di ricerca in silico, secondo aspetto della ricerca che si pone nell’ottica delle 3R: invece di eseguire lo screening delle molecole da indagare sugli animali, infatti, è stato scelto di partire da un attento studio bioinformatico per identificare le possibili molecole d’interesse, selezionandole tra quelle conservate negli animali. Solo a questo punto sono iniziati gli studi in Pomacea, verificando la presenza di tali molecole con una tecnica detta FISH (Fluorescent in situ hybridization) e che, in breve, consiste nell’individuare una sequenza di DNA o RNA (quella da cui saranno poi prodotte le molecole) localizzandola con un marcatore fluorescente che vi si lega.

Lo studio non si è limitato a cercare i marker nelle cellule dell’emolinfa, ma ne ha verificato la presenza anche in alcuni organi. Come spiega Ferri, infatti, «Volevamo capire se le molecole che caratterizzano gli emociti circolanti identificano le stesse cellule anche in matrici tissutali più complesse – in altre parole, gli organi dell’animale. Infatti, non è detto che ciò che possiamo identificare in vetrino contenente solo cellule, come appunto un campione di emolinfa o sangue, sia identificabile anche in tessuto complesso. Saperlo, tuttavia, è importante se poi si vogliono studiare i processi in cui gli emociti sono coinvolti all’interno degli organi».

Qui, di nuovo, è stata scelta una metodologia che consente di ridurre da una parte la sofferenza (in ottica di refinement) e dall’altra il numero di animali coinvolti (in ottica di reduction). Uno degli organi indagati è stato infatti il nefridio, l’organo che funziona da “rene”, posteriore della chiocciola, scelto perché erano disponibili dei campioni provenienti da esperimenti precedenti nei quali gli animali non erano stati sottoposti a trattamenti tali da rischiare di alterare il risultato dell’esperimento. Il secondo organo studiato per la presenza di marker emocitari è stato il tentacolo cefalico, scelto per la sua capacità rigenerativa. «Dopo 12 ore dall’amputazione, il tentacolo s’infiltra di emociti, per cui sapevamo che sarebbero stati presenti. Al contempo, questa scelta ci ha consentito di non uccidere le chiocciole, che nell’arco di tre mesi rigenerano l’organo», spiega Ferri. In aggiunta, parte del tentacolo è stato sottoposto anche a un’altra metodologia di indagine, detta PCR, per verificare che i marker emocitari fossero rilevabili anche con altre tecniche – come è stato infatti confermato.

3R e metodi alternativi: l’importanza dell’aggiornamento


Questo lavoro rappresenta un primo passo importante per lo studio dell’immunità innata in modelli animali di invertebrati. Ricordiamo anche che, non rientrando gli invertebrati (con l’esclusione dei cefalopodi) tra gli animali inclusi direttiva 2010/63/EU per la protezione degli animali impiegati a scopi scientifici, il loro uso può semplificare, dal punto di vista normativo, le attività di ricerca.

«Non sempre è facile convincere un gruppo di ricerca a utilizzare un altro modello sperimentale rispetto al topo, per esempio, in un’ottica di replacement. Da questo punto di vista, Pomacea canaliculata presenta degli indubbi vantaggi: le dimensioni notevoli dell’animale adulto, per esempio, fanno sì che un laboratorio possa utilizzare per gli studi sperimentali lo stesso materiale “standard” di laboratorio pensato per studi su altre specie modello, come il topo, rendendo il passaggio più semplice. Inoltre, Pomacea ha uno sviluppo diretto – senza passare da stadio larvale e metamorfosi – che rende il modello più “familiare” a chi ha sempre lavorato con i vertebrati», commenta Marcello Pinti, professore associato all’Università di Modena e Reggio Emilia e referente per Research4Life. «Da patologo generale, aggiungo che un modello come Pomacea, ospite intermedio di un nematode che può infestare anche l’essere umano, è estremamente interessante anche in ottica sanitaria e di prevenzione delle infestazioni».

«Credo sia importante sottolineare che si tratta di un lavoro di ricerca di base, cioè che non presenta un’immediata e concreta applicazione ma ci permette di conoscere le caratteristiche e i processi biologici degli organismi. Spesso questo tipo di ricerca, che rappresenta quella che ancora ha maggior bisogno di usare gli animali, è percepita proprio per questa ragione come “inutile”: tuttavia, non potremmo mai, per esempio, studiare una terapia senza sapere come funziona un organismo. E, allo stesso tempo, non possiamo pensare di studiare sistemi come quello immunitario, che è anche particolarmente complesso perché coinvolge tutto l’organismo, senza evitare di usare un animale», conclude Ferri. «Questo, però, sempre con la consapevolezza che dobbiamo fare il possibile per non coinvolgere gli animali, quindi usando ogni volta possibile metodi alternativi che si siano dimostrati altrettanto efficaci dell’animale stesso. A sua volta, ciò significa prestare la massima attenzione all’informazione e all’aggiornamento, da parte del mondo della ricerca, per garantire di essere consapevoli degli strumenti che abbiamo, o si rendono, a disposizione».

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